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[拼音]:danbaizhi shunxu fenxi

[外文]:protein sequencing

测定蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序,又称蛋白质的一级结构分析。

测定方法一般需要以下的技术和步骤:蛋白质的纯化,测定分子量,分析辅基或配基,氨基酸定量组成分析,末端分析,拆开二硫键,肽的裂解、纯化及顺序测定,寻找接头肽以连线成完整的肽链,再经过二硫键定位,最后列出完整蛋白质的顺序。

蛋白质的纯化

待测定顺序的蛋白质样品,需要较高的纯度。须通过多种方法鑑定,如末端分析、电泳、等电聚焦、氨基酸定量组成分析等都证明是均一的蛋白质,杂质含量在5%以下,才适于做顺序分析。

测定分子量

一般用凝胶过滤法,十二烷基硫酸钠聚丙烯醯胺凝胶电泳法。从两种资料,还可知道样品蛋白质是否有亚基结构。

辅基和配基分析

简单蛋白质不含辅基和配基。但结合蛋白质含糖、核酸、脂质或其他有机化合物,这些物质会干扰顺序分析,需采用特殊方法除去。

氨基酸定量组成分析

用氨基酸自动分析仪能准确测定蛋白质样品中各种氨基酸的含量,特别是某些氨基酸,如甲硫氨酸、色氨酸、精氨酸和赖氨酸等的含量对设计顺序测定方案很重要。

末端分析

多肽链的一端为NH2,称为N端,另一端为COOH,称为C端。N端测定用FDNB(2,4-二硝基氟苯),DNS-Cl (1-二甲基萘胺-5-磺醯氯)和DABITC(4-NN’二甲基-胺重氮苯-4’-异硫氰酸酯) 等化学试剂测定。也可用氨肽酶法。C 端用肼解法或羧肽酶法测定。有的蛋白质的N末端被其他化学基团,如乙醯基,或环化谷氨酸所封闭,就不能用上述方法测定。通过末端分析也能了解蛋白质由几条肽链组成和样品的纯度。

拆开二硫键

肽链中的半胱氨酸残基,常以二硫键的方式与肽链中的其他部位半胱氨酸残基连线,测定顺序时须先拆开二硫键,使肽链呈松散的直链,便于降解和裂解。拆开方法是用巯基试剂还原羧甲基化,或用过甲酸氧化等。

肽的裂解和纯化

先将蛋白质裂解成较大的肽段,以减少纯化和顺序测定的工作量。在一般蛋白质分子中,甲硫氨酸、色氨酸和精氨酸等含量较少,可用专一性高的试剂或酶针对这类氨基酸的肽键裂解,如用溴化氰,氢溴酸和胰蛋白酶等,能得到预期的结果。肽的纯化,一般用离子交换层析,凝胶过滤,电泳和纸层析等方法。70年代以来采用高效液相层析仪,其解析度高,速度快,是纯化肽的最好工具。

肽的顺序测定

(1)埃德曼降解法。用化学试剂──异硫氰酸苯酯,能依次从N端逐个把氨基酸残基降解下来。每一步反应得到一个氨基酸衍生物。经多次重复的反应就得到更多的降解产物,分别鑑定后,即可列出肽链的氨基酸顺序。根据这个原理设计的自动顺序仪,一昼夜连续运转,可测出10多个顺序。但由于化学反应率的限制,不可能无限制地降解到底,因为即使在最好的条件下,每步反应率到98%,一般只能测到50步左右,这时留下的可供反应的N端愈来愈少,杂质愈来愈多,难以继续测定。所以通常需先把肽链裂解成肽段后再测其顺序。

(2)酶法测顺序。用氨肽酶能从N端依次降解,用羧肽酶能从C端依次降解。酶解释放氨基酸是个动力学过程,需在不同时间取样定量测定,根据释放的过程列出顺序,由于酶解过程难以控制,此法得到的资料,一般仅为几个氨基酸顺序。

接头肽

在完成许多肽段的顺序测定后,需要寻找接头肽以把各肽段连线起来而完成蛋白质的全部顺序。其连线法如图所示。用一个字母表示一个氨基酸残基:

第1种切法ABCDEFG HIKLMNOP QRSTVWXYZ

第2种切法 FGHIKOPQRS

完整的肽链ABCDEFGHIKLMNOPQRSTVWXYZ

二硫键定位

用专一性低的蛋白水解酶,如胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶等水解完整的蛋白质成为小的肽段,经分离纯化,找寻含二硫键的肽段。亚硝基铁氰化钠是二硫键的特殊显色剂。测定这些肽段的氨基酸组成和顺序,即可确定肽链内部二硫键的位置,得到完整的蛋白质的氨基酸顺序。

上面介绍的经典的蛋白质顺序测定法,是非常繁琐而工作量浩大的工作。50年代初测定含51个氨基酸残基的胰岛素花了8年时间,现在用自动化仪器和先进检测工具,只需花一周时间。1978年发表的β-半乳糖苷酶,含1021个氨基酸残基,可以说是经典法测定的顶峰。目前新的快速方法是从核酸(DNA)顺序推测蛋白质顺序,已经广泛采用,因在短期内可测数千个核苷酸顺序,从DNA的三联密码能准确推测出蛋白质的氨基酸顺序。这一方法近年来已经有取代上述经典方法的趋势,但是尽管如此,某些环节还须蛋白质顺序测定的经典法配合。

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